Рестрикционное картирование

Введение

Картирование генома – быстро развивающаяся область исследований. Для ученых, избравших ее своей специальностью, это одновременно и хорошо, и плохо. Хорошо, поскольку это освобождает нас от необходимости соблюдать узкую направленность в своей работе, а плохо, поскольку мы пока незнаем, какой способ картирования дает наиболее реальную картину структуры генома и, следовательно, какие данные больше соответствуют истине. Оглядываясь на путь, пройденный нами в исследованиях по картированию, мы с сожалением должны констатировать: если бы пришлось начинать все сначала, мы вряд ли бы двигались в том же направлении.

Картирование генома подразумевает создание систематизированной библиотеки клонов, которая полностью представляет геном и содержит набор генетических маркеров, достаточный, чтобы строить физическую и генетическую карты. По ходу исследований мы постепенно приближаемся к истинной структуре. В идеале карты, полученные разными способами, должны быть идентичными. Изучение структуры генома не требует обязательного построения рестрикционной карты, однако некоторые способы картирования автоматически приводят к ее получению.

Цель картирования – облегчать процедуру клонирования известных генов и способствовать поиску в геноме интересующих клонов. Наличие карты позволяет легко соотносить друг с другом результаты разрозненных экспериментов по локализации в геноме различных клонов.

1. Стратегия

1.1 Сравнение клонов

В любом методе картирования генома центральной процедурой является сравнение клонов, позволяющее выявить частичные перекрывания. Наиболее просто перекрывания можно обнаружить с помощью гибридизации. Однако саму по себе гибридизацию нельзя считать удовлетворительным критерием взаимного соответствия клонов, так как имеющиеся в геноме, особенно у эукариот, диспергированные повторы могут давать ложноположительные ответы. Кроме того, прямое сравнение пар – процедура слишком трудоемкая, чтобы использовать ее для реализации программы, требующей сопоставления большого количества клонов. Более приемлемым представляется такой подход, который позволяет постепенно накапливать информацию о каждом клоне, а затем анализировать ее.

Большинство методов картирования в настоящее время основано на обработке ДНК генома одной или несколькими рестриктазами с последующим определением размеров образующихся фрагментов. Для этой цели предложен ряд методик.

Вначале мы бы хотели коснуться приема, использованного нами при анализе структуры генома нематоды Caenorhabdltis elegans. Он получил название «метод отпечатков пальцев» и подразумевает использование неупорядоченных и неполных наборов фрагментов, которые являются характеристикой клона, хотя и описывают его неполностью: фрагменты разделяют с помощью электрофореза в тонкослойном полиакриламидном геле.

1.2 Векторы

Стратегия картирования основывается на анализе случайно отобранных клонов. Совершенно ясно поэтому, что при картировании необходимо иметь как можно более обширную библиотеку клонов. Желательно также, чтобы размер клонированных вставок позволял их использовать в дальнейшем в биохимической генетике.

Первоначально мы выбрали для экспериментов космиды из-за сравнительно крупных размеров акцептируемой ДНК. ............