Подвижная и неподвижная фазы
Переходя к рассмотрению вариантов истинной хроматографии, полезно ввести понятия «подвижной» и «неподвижной» фаз. Имеется в виду движение фракционируемых молекул вниз по колонке. Подвижную фазу, естественно, составляют молекулы, находящиеся вне гранул. Они движутся вместе с током элюента. Неподвижную фазу — молекулы, находящиеся внутри гранул. Такое разделение имело место и при гель-фильтрации. Там неподвижные в указанном смысле молекулы были таковыми в силу их растворения в неподвижной водной среде, заполнявшей гранулы. Конечно, и в этой среде они совершали броуновское движение, но это не подвигало их к выходу из колонки. С материалом самих гранул они если и взаимодействовали, то чисто механически — наталкиваясь на нити полимера, образующего гранулы.
В случае ионообменной хроматографии, наоборот, неподвижную фазу, в основном, составляют молекулы определенным образом связанные с материалом гранул («сорбированные» на нем). Пористость последних в этом случае выбирают так, чтобы фракционируемые молекулы могли бы практически беспрепятственно проникать в гранулы, заполняя весь их внутренний объем.
Само название ионообменная хроматография указывает на то, что связь молекул с гранулами должна быть ионная. То есть определяться кулоновскими силами притяжения между ионами противоположных знаков, закрепленными на нитях гранул и существующими на поверхности молекул. Слова «закрепленные» и «существующие» наводят на мысль о раз и навсегда фиксированной ситуации. Между тем, гибкость и эффективность метода ионообменной хроматографии опирается как раз на возможность управления этой ситуацией, а вместе с ней и силой связи молекул фракционируемого вещества с матрицей гранул — характером сорбции этих молекул.
Ионогенные группы
Вместо неизменных ионов на нитях матрицы и на поверхностях макромолекул (например белков) располагаются «ионогенные группы», которые в зависимости от условий в окружающей их водной среде (рН, наличие солей) могут проявлять себя либо как открытые, несущие электрический заряд ионы, либо быть нейтрализованными за счет сближения с ними несущих противоположный заряд ионов, например Na+ или С1-, а иногда за счет диссоциации или присоединения протонов Н+.
На поверхности белков ионогенными группами заканчиваются боковые ветви таких аминокислот, как лизин и аргинин или аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Диссоциация протона в первом случае и ассоциация во втором нейтрализуют эти группы. Оба эти процесса зависят от концентрации протонов в окружающей водной среде, т. е. от величины рН (соответственно в щелочной или кислой области). Вместо химической модификации, каковой являются оба названных явления, нейтрализация заряда ионогенной группы может происходить и за счет его экранизации противоположно заряженным ионом, подходящим под действием кулоновской силы вплотную к ионогенной группе из окружающей среды. Ковалентной химической связи не образуется. Экранирующий ион в этом случае именуется «контрионом».
Ионогенные группы, способные проявлять свой положительный заряд, именуются «анионитами» — они в какой-то мере подобны аноду в электрической цепи. ............
