Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией
ВВЕДЕНИЕ
Определять ферментную метку количественно можно различными методами, например, с помощью колориметрии, флуориметрии, радиометрии и потенциометрии. Недавно для этой цели стали применять также хемилюминесценцию или биолюминесценцию. Ферментные метки, которые можно определять с помощью реакций, сопровождающихся излучением света, представлены в табл. 1. В общем случае чувствительность хеми- и биолюминесцентных методов определения очень высока, а если использовать еще и усиление сигнала от ферментной метки, то чувствительность соответствующих методик иммуноанализа должна быть чрезвычайно высокой. Возможности биолюминесцентного метода недавно были продемонстрированы на примере определения Д-галак-тозидазы. С помощью сопряженной реакции галактозо-дегидроге-наза АОН:РМ№оксидоредуктаза-бактериальная люцифераза удалось обнаружить 2 • 10"22 моля /3-галактозидазы.
В качестве метки в иммуноферментном анализе широко применяют пероксидазу хрена, методы получения и стабилизации конъюгатов с которой хорошо изучены. Пероксидазу хрена чаще всего определяют колориметрически, но для этой цели можно также использовать различные хеми- и биолюминесцентные реакции.
Детально изучено определение пероксидазы с помощью хеми-люминесцентной реакции в системе люминол - пероксид водорода, усиленной фенольными соединениями. Такой подход к определению активности фермента имеет ряд преимуществ в сравнении с другими методами определения; его основные характеристики перечислены в табл. 2.
Усилители. Способностью усиливать излучение света в реакции окисления люминала пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой, обладают различные соединения, в том числе 6-гидроксибензотиазолы, например люциферин, фенолы, нафтолы и амины. На рис. 1 изображены структуры представителей веществ каждого класса. Степень усиления излучения света зависит от концентрации реагентов. Типичная зависимость интенсивности свечения от концентрации усилителя в реакции люмино-ла с пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой и усиливаемой 6-гидрокси-бензотиазолом, представлена на рис. 2.
Синергизм и степень усиления. В системе перокси-даза - люминал - пероксид водорода наблюдается эффект сине-
ргизма, о чем свидетельствуют данные, приведенные в табл. 3. На степень усиления влияют многие факторы; тем не менее достигнуто усиление излучения света более чем в 500 раз. В присутствии некоторых усилителей фоновое излучение света в системе люминол - пероксид водорода уменьшается. При определении активности пероксидазы это позволяет на несколько порядков повысить отношение сигнала к шуму только, за счет применения таких усилителей.
Усиление свечения характерно для различных циклических диацилгидразидов, при действии окислителей в присутствии пероксндазы. Усиление не наблюдается в случае некоторых веществ с пероксидазной активностью, например гемоглобина, который катализирует только колориметрические реакции. Этот факт свидетельствует о более высокой специфичности усиленного хемилюминесцентного анализа по сравнению с колориметрическими методами. Спектры излучаемого света практически одинаковы в усиленных и неусиленных реакциях. ............
