Биосинтез 2h-меченого инозина высокого уровня дейтерированности
О. В. МОСИН*
*Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, 117571 Москва, просп. Вернадского, 86.
Осуществлен биосинтез 2Н-меченого пуринового рибонуклеозида инозина (выход 3.9 г c 1 л ростовой среды) с использованием адаптированного к дейтерию штамма Bacillus subtilis в тяжеловодородной среде высокого уровня дейтерированности (89-90 ат.% 2Н) с 2% гидролизатом биомассы метилотрофной бактерии Brevibacterium methylicum как источника 2Н-меченых ростовых субстратов (условия синтеза: синтетическая среда М9 с 98% 2Н2О и 2% [U-2H]метанолом, инкубационный период 5-6 сут при 370С). Исследование уровня дейтерированности биосинтетического инозина методом масс-спектрометрии FAB выявило полиморфизм включения дейтерия в молекулу (изотопный состав инозина: 4 ат. 2Н, 20%; 5 ат. 2Н, 38%; 6 ат. 2Н, 28%; 7 ат. 2Н, 14%) с включением дейтерия в рибозный и гипоксантиновый фрагменты молекулы.
Ключевые слова: Bacillus subtillis; 2Н-меченый инозин; биосинтез; масс-спектрометрия FAB.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N, 18О и др), которые необходимы для многочисленных биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также для изучения клеточного метаболизма [3]. Тенденции к предпочтительному использованию стабильных изотопов по сравнению с радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н ЯМР [4, 5], ИК- и лазерной спектроскопией [6], а также масс-спектрометрией [7]. Развитие технической и компъютерной оснащенности аналитических методов позволило существенно повысить эффективность проведения биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия БАС на молекулярном уровне [8]. Большое научно-прикладное значение в этом аспекте имеют соединения нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном скелете молекулы [9]. В частности, 2Н-меченые рибонуклеозиды в ближайшем будущем смогут найти применение в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для изучения их пространственной структуры и конформационных изменений [10].
Важным моментом в исследованиях с применением изотопно меченых БАС является их доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с использованием химических, ферментативных и биосинтетических методов [11, 12]. Однако химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм, для разделения которых требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с комбинацией химических [14] и ферментативных подходов [15, 16]. Стратегия синтеза изотопно-меченых БАС более подробно освещена в работе ЛеМастера [17].
Для многих научно-практических целей биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу биосинтетический метод получения дейтериймеченых БАС, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению дейтерия в молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18]. Традиционным подходом при этом остается предложенный Креспи метод выращивания штаммов-продуцентов в средах с максимальными концентрациями дейтерия [19]. Однако основным препятствием является недостаток 2Н-меченых ростовых субстратов с высоким уровнем дейтерированности. ............
