БИОСИНТЕЗ 2Н-МЕЧЕНОГО БАКТЕРИОРОДОПСИНА ГАЛОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИЕЙ HALOBACTERIUM HALOBIUM
О. В. МОСИН*
* Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86;
Осуществлен биосинтез мембранного белка бактериородопсина галофильной бактерией Halobacterium halobium, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана. Комбинацией методов разделения и анализа, включая электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-200, обращенно-фазовую ВЭЖХ, спектроскопию 1Н ЯМР и масс-спектрометрию электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных-производных аминокислот, доказаны гомогенность синтезируемого 2Н-меченого БР и селективность включения дейтерия в молекулу.
Ключевые слова: Halobacterium halobium; [2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин, [3, 5-2H2]тирозин, [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан, 2Н-меченый бактериородопсин; биосинтез; масс-спектрометрия
ВВЕДЕНИЕ
Ретинальсодержащий белок (хромофор - протонированный альдемин ретиналя с e-аминогруппой Lys-216) - бактериородопсин (БR) выполняет функции АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium [1]. Несмотря на его структурно-функциональную изученность, он остается в центре внимания биотехнологии из-за своей высокой светочувствительности и разрешающей способности и используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал [2]. БR также привлекателен, как модельный объект для изучения функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе искусственно сконструированных энергопреобразующих мембран [3].
Для целого ряда структурно-функциональных исследований с БР целесообразно вводить в молекулу белка изотопную метку дейтерия, позволяющую использовать для последующего анализа изотопного включения метод высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара [4, 5]. Поэтому большое научно-прикладное значение имеет БR, меченный дейтерием по остаткам функционально важных ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана, участвующих в гидрофобном взаимодействии полипептидной цепи белка с липидным бислоем клеточной мембраны [6]. 2Н-меченые ароматические аминокислоты могут быть синтезированы с препаративными выходами методом обратного изотопного обмена (1Н-2Н) в молекулах протонированных аминокислот - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500C, [3, 5-2H2]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении реакционной смеси, [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан в 75% 2H-меченой трифторуксусной кислоте при 250С [7, 8]. Однако несмотря на изученность современных методов химического синтеза 2Н-меченых ароматических аминокислот, отечественная индустрия индивидуальных 2Н-меченых мембранных белков не получила необходимого развития.
В настоящей работе осуществлен биосинтез БР, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана для реконструкции искусственных мембран с последующим микропрепаративным выделением, а также исследован уровень дейтерированности молекулы БР методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Днс)-производных аминокислот с обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выбор стратегии биосинтеза 2Н-меченого БР c использованием штамма экстремальной галофильной бактерии Halobacterium halobium определялся целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения 2Н-меченых препаратов мембранного белка в микропрепаративном количестве для реконструкции искусственных мембран. ............
